高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出， 通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

据中金企信国际咨询公布的《2020-2026年中国高效液相色谱仪行业市场分析及投资可行性研究报告》统计数据显示：目前，全世界大约有近40多种高效液相色谱仪检测器；现在主要给大家介绍几种常用检测器的现状。

（1）紫外检测器：紫外检测器是高效液相色谱仪中最常用的检测器。它是最广泛使用的具有最广泛覆盖的检测器，占HPLC检测器覆盖范围的大约75％。基本上，它可以应用于所有具有紫外吸收的物质的分析和检测。任何HPLC至少应有一个紫外检测器。

（2）荧光检测器（fld）：fld占高效液相色谱仪检测器的15%左右，所有苯环类物质基本上都是致癌物和荧光物质，fld具有灵敏度高的优点，因此fld被广泛应用。

（3）差示折射计(RID)：RID是一种高质量、非选择性的检测器，其覆盖率约为HPLC检测器的5%；然而，由于它受温度的影响，环境温度的微小变化将对检测器的结果产生很大的影响。

（4）蒸发光散射探测器（ELSD）：ELSD近年来发展迅速，在许多领域得到了广泛的应用。目前，它的使用范围比RID大，所以很快就会取代RID。其覆盖面积估计约为10%。

产品应用： 

一、生物化学：高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，几乎遍及定量定性分析的各个领域。HPLC可将不同的蛋白质分离并检测，不但有很高的灵敏度且实现了分析自动化，对医药、临床病理、预防学等蛋白质化学领域的研究提供了强有力的手段。HPLC应用于细菌的分子生物学鉴定和细菌细胞的化学成分分析可直接测定细菌DNA的碱基组成和细菌的化学组分，为细菌的分类鉴定提供有利的证据。但是HPLC在具体分析的过程中还有很多问题有待解决。相信高效液相色谱这种分析方法随着仪器分析技术的不断发展必然将会对生物学领域做出更大的贡献。

1、高效液相色谱法在微生物分析鉴定中的应用：HPLC应用于细菌的分子生物学鉴定和细菌细胞的化学成分分析可直接测定细菌DNA 的碱基组成和细菌的化学组分，为细菌的分类鉴定提供有利的证据。因此，HPLC 在微生物鉴定中的应用越来越受到人们的关注。 

（1）细菌DNA 的G+ C含量测定：每一种细菌DNA G+ C含量通常是恒定的，不受菌龄、生长条件等各种外界因素的影响，故它作为鉴定细菌种、属间的亲疏关系的重要指标已被人们所公认。在伯杰细菌系统学手册中将细菌DNA G+C含量作为细菌分类鉴定的重要指标，可见细菌DNA的G+C含量测定在细菌鉴定中的重要性。DNA经酶水解后得四种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，它们的化学结构中均存在共轭双键，在260nm波长处有最大吸收，因此可用常见的UV—HPLC 法直接测定细菌DNA G+C含量。测定DNA G+C含量的方法已有众多研究报道，主要包括热变性温度（Tm）法、浮力密度法和HPLC法，其中快速、准确的方法当HPLC法。

通常情况下，中性分子在反相色谱柱中具有更好的柱效。

HPLC测定细菌DNA G+C含量是一个快速、准确可靠的方法。但是，在应用这个方法时应注意下列几点：

细菌DNA应高度纯化，按常规方法提取与纯化的细菌DNA，不宜直接用HPLC测定G+C含量。样品中残留的RNA等明显影响G+C含量测定的准确性，必须用核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1进一步处理。否则，较多的杂质峰将影响碱基峰的形成而使G+C含量测定出现较大误差。

测定细菌DNA的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷均可计算出DNA G+C含量。但应注意，测定核苷酸时宜选用离子交换色谱系统，而测定核苷时宜选用反相色谱系统。 

荧光检测器比紫外检测器的灵敏度高，在条件具备或样品量很低时，尽量选择荧光检测。

（2）枝菌酸的分析：枝菌酸是一类仅存手棒状杆菌（C20～C38）、迪茨氏菌属（C34～C38）、红球菌属（C34～C52）、诺卡菌属（C40～C60）、戈登氏菌属（C48～C66）、williamsia （C50～C56）、Skermania （C50～C64）、冢村氏菌属（C64～C78）和分枝杆菌（C60～C90）细胞壁中的α2烷基、β2羟基高分子脂肪酸。二维薄层层析和质谱证实各种分枝杆菌中含不同的枝菌酸。HPLC 能够分离各枝菌酸是基于枝菌酸碳链长度、不饱和度和其官能团，而HPLC分类、鉴定含枝菌酸细菌是基于各枝菌酸溴代苯甲酰脂肪酸酯的特征图谱或保留时间不同。将样品测定图谱与已发表的分枝杆菌参考图谱比较可进行鉴定，若没有标准参考图谱，可利用标准株或基因鉴定菌株制备。HPLC可鉴定分枝杆菌到种的水平。

HPLC是一个快速、简便和费用低廉的种特异性鉴定分枝杆菌的方法，值得大力推广应用。但是HPLC 鉴定分枝杆菌需要标准图谱作为对照，鉴定时需要参考文献图谱，建议最好购买现成的分枝杆菌图谱数据库或自行建立数据库并结合计算机辅助进行鉴定。随着鉴定数量的不断增加，可将鉴定到的新菌种图谱不断充实到数据库中，使得鉴定范围不断扩大，从而使其真正成为在临床或实验室进行分类鉴定分枝杆菌的常规手段。 

（3）醌类的分析：醌是细菌细胞质膜和线粒体膜的组成成分，在电子传递链和氧化磷酸化中起重要作用。除了具有这些重要的生理功能，类异戊二烯醌作为细菌分类的重要化学指标常用于细菌的分类鉴定。许多研究表明细菌中含有的两个主要类型的醌一萘醌和苯醌均具有类异戊二烯侧链，而且侧链各不相同，醌的类型（泛醌、甲基萘醌和它们的衍生物二氢甲基萘醌、二甲基甲基萘醌和深红醌）、类异戊二烯侧链长度和饱和度构成了化学分类鉴定细菌之基础。高效薄层层析（HPTLC）可有效地分析泛醌类异戊二烯侧链，但分析甲基萘醌类异戊二烯侧链受到限制。反相薄层层析（RP-TLC） 虽能有效地分析甲基萘醌，但分析甲基取代的甲基萘醌不够理想。高效液相色谱法（HPLC）在以上存在的两种情况中均能有效地进行分析。以紫外检测高效液相色谱仪、RPl8 柱（5μm粒径，150×4. 6 mm）、270nm检测波长分析醌。通过与可靠的标准品比较鉴定各种类型的醌，当用HPLC分析细菌中醌类鉴定细菌时，必须将测定样品与标准品图谱对照。因为HPLC分析醌类鉴定细菌是定性分析细菌中的醌，分析条件的微小变化都会影响某种醌保留时间的长短，使我们无法进行正确判断。此外，仅靠一张HPLC图谱就对细菌作出鉴定难免有些草率。因此，准确鉴定时，除了进行HPLC测定外，还应作紫外光谱、质谱和核磁共振谱分析。 

（4）多胺的分析：多胺是构成细菌细胞的化学成分，它的类型可作为细菌化学分类的标志。目前，已经证明多胺的类型可用于属于蛋白菌类的革兰氏阴性菌的分类鉴定，它在革兰氏阳性菌分类鉴定中的作用还没有得到完全证实。一般α-亚类蛋白菌主要含三胺（亚精胺或对称一同系亚精胺）；β-亚类蛋白菌具有同系多胺类型，它们共同的特征为主要含丁二胺；γ-亚类蛋白菌肠杆菌科欧文菌属主要含二氨基丙烷和丁二胺，相关的弧菌属主要含三胺（对称一正亚精胺）；黄单胞菌属、弗拉特氏菌属、盐单胞菌属、德莱氏菌属和海洋螺菌属的共同特征为主要含亚精胺，寡养单胞菌属主要含戊二胺和亚精胺。将干燥菌置于试管中，加入一定量0. 2mol/ L 高氯酸，100℃加热30min，离心后，上清液在60℃进行碱化和旦磺酰化，然后加脯氨酸溶液除去多余的旦磺酰氯，用甲苯抽提出旦磺酰多胺备用。采用RPl8色谱柱、荧光检测器和乙腈/ 水梯度洗脱系统进样分析旦磺酰多胺。

多胺的分析可用于细菌的分类鉴定，但仅适用于某些革兰氏阴性菌，况且仅依靠多胺的类型不能完全确定某种菌，因此用本法分类鉴定细菌时需与其它方法进行比较，防止得出错误的结论。 

2、利用高效液相色谱（HPLC）分离蛋白质：蛋白质在物理、化学及功能等特征上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性以及蛋白质的来源、实验要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质。 

（1）反相高效液相色谱：在HPLC各种模式中，RP-HPLC应用最为广泛。其固定相是非极性的，而流动相是比固定相极性更强的溶剂系统。蛋白质分子疏水性的不同使其在两相中的分配不同而得到分离。近10几年来，RP-HPLC以其高分辨力、快速、重复性好等优点广泛应用于蛋白质的分离分析。 

有利于蛋白质分离的条件于1970年首次提出，即低pH值流动相、室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分。三氟乙酸（ TFA）作为离子对试剂，是反相色谱中最常用的添加剂。蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性质有关，实验证明，大孔硅胶（20～30nm）短链烷基键合固定相适合蛋白质的分离；另外，无孔径载体柱对分子量相差较大和疏水性很强的蛋白质混合物的分离效果很好。从分子量6000的胰岛素到分子量66000的牛血清白蛋白在无孔径载体柱上均能得到良好的分离，并且分离速度很快（一般2～5min），较高的柱温还能改善蛋白质混合物的分离；Daniel B. Wall等利用C18非多孔硅粒载体柱实现了细胞溶菌物中蛋白质的快速分离。并且，利用这种方法，在15min内大肠杆菌的整个细胞溶菌物水溶液中的蛋白就可以得到很好的分离。 

（2）高效离子交换色谱：HPIEC是根据蛋白质分子在一定的pH和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。这种技术已经成功地用于分离蛋白质，并且，当选择的流动相的 pH 值合适时能维持蛋白质的生物活性。由于HPIEC是一吸附性的梯度洗脱过程，所以具有很好的负载力。近几年来HPIEC也成为分离检测蛋白质的重要方法。并且，人们的研究证明HPIEC与RP-HPLC都是分离膜蛋白的首选方法。 在离子交换色谱填料研究方面，聚合物离子交换剂颇受重视。因为这种固定相具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点。

（3）高效凝胶过滤色谱：凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱（Size exclusion chromatography，SEC），是根据分子相对大小进行分离的一种色谱技术。相对于吸附性液相色谱技术而言， SEC的分辨力和样品负载力都很低。SEC又是一种温和的技术，可用来平衡柱及分离样品的缓冲液范围较广。所以近年来关于利用SEC 分离蛋白质的报道也不少。例如，Bunger H等成功的分离出疏水性肺的表面活性剂蛋白SP-B、SP-C；另外SEC特别适合对蛋白质分子量的研究，利用SEC 能够快速分离出人血清白蛋白HAS的降解产物，结合特定的检测器即可测定其单体和二聚体的分子量。 

（4）高效亲和色谱：蛋白质在行使功能时必须和底物、受体或抑制剂等分子进行生物专一性结合，这种高度专一性结合特性可用于亲和色谱分离。HPAFC是蛋白质检测中最专一的分离技术，可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质，特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。周冬梅等研究了蛋白A高效亲和色谱对水溶液及人血浆中免疫球蛋白G（HIgG）的特异性吸附和定量测定，方法具有较高的精确度和重复性。通过HPAFC可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白等，也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等，可见HPAFC在蛋白质化学中起着重要作用。 

（5）其他液相色谱模式：高效疏水色谱（HIC）是用来分离构象不稳定蛋白质的技术之一，其分离机制类似于反相液相色谱，只是用水性缓冲液代替了有机溶剂；以键合氟化物作固定相，用SDS或CTAB作流动相的胶束高效液相色谱中，胶束提供了一个溶质溶解的非均相环境，可用于蛋白质的分离；近年来，人们将非线性色谱理论应用于蛋白质分离中，更加完善了高效液相色谱技术。在实际应用中，特别是复杂样品，通常采用几种分离模式结合使用才能获得理想的目标产物。 

3、蛋白质分离检测的HPLC联用技术：为了使蛋白质的检测更加准确方便，人们研究了各种HPLC联用技术。目前常用的比较成功的联用技术主要有：高效液相色谱—质谱（HPLC-MS）、高效液相色谱—毛细管电泳（HPLC-CE）、高效液相色谱—等速电泳（HPLC-ITP）、高效液相色谱—电感耦合等离子体原子发射光谱（HPLC-ICP-AES）。 

（1）HPLC-MS联用技术：HPLC-MS 联用技术是近年来研究的热点，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。随着电喷雾（ ESI）接口技术的发展，HPLC-ESI-MS 联用技术为蛋白质的检测提供了强有力的工具。这种技术耗样量少、精确度高、快速方便，并且可以用于不纯或者复杂混合物的分析。我国研究工作者利用HPLC-ESI-MS联用技术对溶菌酶和牛血清蛋白分别进行定性定量分析以及对其混合物进行检测，取得了较满意的结果。另外，HPLC-MS-MS 联用因其通用性以及高灵敏度在蛋白质分析中也有着重要的应用。 

（2）HPLC-CE联用技术：HPLC-CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离。在分离检测复杂蛋白质样品时，HPCE可以作为HPLC的补充，有时利用HPLC无法分离的蛋白质在HPCE上即可得到很好的分离。另外，毛细管区带电泳（CZE）与HPLC联用也可以很好的分离检测一些蛋白质。 

（3）HPLC – ITP联用技术：高效液相色谱和等速电泳都是近年来发展较快的分离分析方法，二者联用可以分离分析成分和复杂的蛋白质样品。曾经有人将ITP作为一种预处理技术与 HPLC联用，我国研究工作者建立了新的联用系统，成功地研究了含蛋白质和一些金属离子的复杂样品的分离分析。 

（4）HPLC-ICP-AES联用技术：ICP-AES是十分重要的化学形态分析技术，HPLC与ICP-AES的结合使之具有多元素同时检测的特性。国外科学家利用此联用技术对人类肝部的金属硫蛋白中的金属分布作了准确的定性定量分析。 

二、食品分析：食品中尤其是水果和蔬菜，都含有一定量的维生素C。

维生素C不但具有生理活性，而且在人体内能阻止亚硝胺的形成，具有一定的防癌作用。所以，分析食品中的VC含量，将对鉴别水果和蔬菜的营养价值及衡量保鲜程度具有重要的意义。

维生素C（也称抗坏血酸）的定量分析在食品、药物等领域相当重要，其测定方法很多，包括药典中的标准方法-碘量法，还有比色法，电位滴定法，化学法。高效液相色谱分析VC也有报导。用高效液相色谱分析VC显示出它快速准确的优点。在分析红颜色样品时，HPLC要比化学法准确得多。这就是HPLC分析VC的优越性之一。用HPLC分析VC的另一个优点就是可以直接进入液体样品。

三、医药研究：

1、分离分析药物的组分含量：由于一种药剂常含有多组分，色谱方法是既能分离又能定量的方法。如脂溶性维生素片，含有铬维生素，有C18柱及含1%碳酸铵的甲醇为流动相。一次即可将各维生素B6、D1、A、E同时分离并定出含量。又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。 

2、药物生产中进行中间控制：生产抗菌素时，首先要了解发酵液中的主体与付产物的存在情况。例如：青霉素、四环素、头孢子菌素、红霉素、柔红霉素、庆大霉素等的发酵产物，均可用C18柱和甲醇及缓冲液配制的流动相或用离子对法，分析主体及其收产物的含量。对普鲁卡因酰胺、茶碱等可进行主体含量的测定，对硝酸甘油可测定主体含量及其降解产物，以便保证药物的热量。 

3、分析药物在体内的残量：这是近来研究新药效能很主要的内容之一，如冬凌草甲素是植物中的一组分，有抗癌效果，但是毒性大。测定其在血清中含量很重要，现在可用C18柱及甲醇水为流动相，测定处理后的血清样品，即可得到血中的含量。如磺胺类药品在血清及尿中含量也不允许太大，可用C18柱及酸性乙醇为流动相，测定含量后，则可估计最合适的用药剂量。又如四环素、巴比妥酸、止痛药、退烧药、护糖尿病的药物等，在血或尿中的含量都可用C18柱用甲醇、水为流动相来测定含量。因此，反相色谱法应用范围极广。 

4、测定药物在各种器官中的代谢产物，特别是研究药物的代谢产物在血清中存在的情况。如测血清中的酮酸及戊二酸。测尿中代谢产物更为方便，不需要繁锁的预处理。因为研究尿中的组分能鉴别病人的代谢功能，对病理研究或监床诊断均具有重要的参考价值。

四、环境分析：嘧磺隆是磺酰脲类除草剂中的典型品种之一，最早由美国杜邦公司Geroge Levitt等人研究开发成功，1982年在美国实现了商品化，我国90年代初开始研究，引进这一新型农药品种和生产技术，目前已有小批量生产并投入使用。

该农药主要用作林地和非耕地除草剂，农田禁用，由于嘧磺隆能抑制植物根部细胞分裂而阻止植物生长，严重时可使植物叶部失绿而坏死，所以，随着这一新型农药的生产和应用，必然会带来一些环境（尤其是水体、农业和生态环境等）问题。因此，研究嘧磺隆的环境污染监测方法显得必要。

1、主要仪器与试剂

SY5000型高效液相色谱仪；UV-1型254nm紫外光检测器和3390A型记录仪。

嘧磺隆标准贮备液：400mg/L。准确称取嘧磺隆标准0.0400g。溶入二氯甲烷，转入100ml容量瓶并定容。嘧磺隆标准使用液：40mg/L。准确移取10.0ml贮备演于l00ml容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。所用其它试剂为分析纯或优级纯。

2、色谱条件

色谱柱为内径4mm，长30cm，装填固定相l8烷基硅烷（ODS， 的不锈钢柱。流动相为甲酵85％、水15％，流速1.0ml/min，柱温28℃，检测器波长254nm．走纸速度5ram/min。

3、水样萃取富集方法

取1000ml水样于1000ml分液漏斗中， 加入5ml10％（v/v）硫酸，15ml二氯甲烷，摇动5min，中途放气2-3次，静置30min，下层有机相转入25ml容量瓶中，水相再用10ml二氯甲烷重复萃取一次，两次萃取液合并，并用二氯甲烷定容至25ml刻度，摇匀备测。

4、工作曲线

于各盛l000ml自来水的七个分液漏斗中，分别加入0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml嘧磺隆标准使用液，然后按水样萃取方法萃取并测定，用计算器统计出回归方程，样品以此定量。

5、结果与讨论

（1）色谱分离条件的选择

研究发现，在甲醇为85％、水为15％、柱温为28℃、流速为1.0ml/min、走纸速度为5mm/min的条件下，嘧磺隆与溶剂二氯甲烷等能很好分离。

（2）萃取条件研究

萃取剂及溶剂的选择

先后试验了石油醚、三氯甲烷、四氯化碳、二氯甲烷等对嘧磺隆的萃取性能和在色谱中溶剂与溶质的分离性能，最后选择用二氯甲烷为萃取剂，同时，配制嘧磺隆标准时，用二氯甲烷作溶剂。

酸度对萃取率的影响

实验发现，只有在酸性溶液中，嘧磺隆才能被二氯甲烷萃取，其萃取效率随酸度变化。随着酸度提高，萃取效率迅速增加，pH<3.5时，萃取率达最大且恒定不变，以后萃取选择pH=2-3。

摇动时间对萃取率的影响

在相同的实验条件下试验了萃取时间对萃取率的影响。结果表明，摇动时间长于3min，萃取率趋于恒定，以后摇动萃取时间选择5min。

萃取次数对萃取率的影响

试验了25ml二氯甲烷分一次萃取和两次（第一次15ml，第二次10ml）萃取对萃取率的影响，结果表明，一次萃取的平均萃取率为95％，二次萃取的平均萃取率为100.3％，以后实验萃取2次。

静置时间的影响

实验表明，二氯甲烷与水相充分分层需30min。

（3）实际样品测定

用本方法可以测定嘧磺隆生产厂总排放口废水和附近农田井水（怀疑受污染）。结果表明，样品测定的最大相对标准偏差为5％，加标回收率在93%-107％之间，可见，方法具有可靠的准确度和较高的精密度。

（4）最低检测量和最低检测浓度

按2倍噪音响应信号算得本方法最低检测量为2ng。根据连续五天全程序空白值，求得本方法最低检出浓度为0.004mg/L。

五、无机分析等：高效液相色谱在有机分析中已取得了很大成功，但在无机分析中的应用研究起步较晚，至今尚没有从理论上彻底研究过。尽管如此，近年来，人们对HPLC在无机分析中的应用越来越感兴趣，这是因为无机分析中所分析的金属离子要转换成以金属有机化合物或金属整合物的形式测定，而这些化合物大多是缺少足够的挥发性和热稳定性，在用气相色谱法（GC）时，在柱操作温度下被测化合物很可能分解，而HPLC的明显优点是可以在常温下操作，各种分离方式，如：正相、反相、反相离子对、离子交换和排阻色谱等都是有效的分离手段。多元流动相、胶束流动相等的使用，进一步扩大了HPLC的应用范围。各种检测方法的研究，提高了分析的灵敏度。